Refusé au Conservatoire au terme de deux années d'études au centre du spectacle de la rue Blanche, Michel Serrault signe son premier contrat en 1946, pour une tournée en Allemagne. Il y joue notamment Les fourberies de Scapin. En 1948, il fait son service militaire à Dijon dans l'aviation. De retour à Paris, il apparaît dans Dugudu, le second spectacle de Robert Dhery après Les Branquignols. C'est en 1952 qu'il rencontre Jean Poiret aux matinées classiques du théâtre Sarah-Bernhardt. Ils interprètent ensemble le sketch Jerry Scott, vedette internationale.
Le 1er février 1973, au Théâtre du Palais Royal, c'est la création de La cage aux folles, la pièce de Jean Poiret qui connaît une carrière triomphale et fait de Michel Serrault une vedette. Il jouera le rôle d'Albin pendant plus de cinq ans, sans pour autant interrompre une carrière cinématographique où son nouveau statut lui permet d'être plus exigeant que par le passé. Étrangleur de femmes dans L'Ibis rouge (Jean-Pierre Mocky, 1975), banquier véreux dans L'Argent des autres (1978), Michel Serrault semble de plus en plus souvent tourner le dos aux rôles comiques si nombreux au début de sa carrière. C'est néanmoins son personnage d'Albin qui lui vaut, en 1979, le César de l'interprétation masculine dans La Cage aux folles, l'adaptation à l'écran par Edouard Molinaro de la pièce de Jean Poiret.

À la fin de sa vie, l'acteur jouait plutôt des rôles de « pépé » campagnard à la française, un peu rustre, mais au grand cœur, comme dans Les Enfants du marais de Jean Becker, avec Jacques Villeret et Jacques Gamblin, ou Une hirondelle a fait le printemps de Christian Carion et Albert est méchant aux côtés de Christian Clavier.

Il souffrait d’une maladie rare, appelée polychondrite atrophiante, qui se caractérise, entre autre, par la diminution des cartilages du nez et des oreilles.

Il avait été hospitalisé dans ses dernières semaines à l'hôpital américain de Neuilly-sur-Seine d'où il était sorti fin juin pour se rendre dans sa résidence secondaire à Équemauville. Il est mort à Équemauville le 29 juillet 2007, à l’âge de 79 ans, des suites d’un cancer.